Ribonukleases H pertama kali ditemui di makmal Peter Hausen apabila penyelidik menemui aktiviti endonuklease hibrid RNA:DNA dalam timus anak lembu pada tahun 1969 dan memberikannya nama "ribonuklease H " untuk menetapkan kekhususan hibridnya.[25][60][61] Aktiviti RNase H kemudiannya ditemui dalam E. coli[62] dan dalam sampel onkovirus dengan genom RNA semasa kajian awal transkripsi songsang virus.[63][64] Ia kemudiannya menjadi jelas bahawa ekstrak timus anak lembu mengandungi lebih daripada satu protein dengan aktiviti RNase H,[65] dan E. coli mengandungi dua gen RNase H.[66][67] Pada asalnya, enzim yang kini dikenali sebagai RNase H2 eukariot telah ditetapkan sebagai H1 dan sebaliknya, tetapi nama enzim eukariot telah ditukar untuk memadankan mereka dalam E. coli bagi memudahkan analisis perbandingan, menghasilkan tatanama moden di mana enzim prokariot ditetapkan dengan angka Rom dan enzim eukariot pula dengan angka Arab.[2][25][30][68] RNase HIII prokariot yang dilaporkan pada tahun 1999 ialah subjenis RNase H terkini yang dikenal pasti.[30]

Pencirian RNase H2 eukariot ialah satu cabaran sejarah, sebahagiannya disebabkan oleh kelimpahannya yang rendah.[2] Usaha berhati-hati dalam penulenan enzim mencadangkan bahawa tidak seperti E. coli RNase H2, enzim eukariotik mempunyai beberapa subunit.[69] Homolog S. cerevisiae protein E. coli (iaitu subunit H2A) mudah dikenal pasti oleh bioinformatik apabila genom yis dijujukkan,[70] tetapi protein yang sepadan didapati tidak mempunyai aktiviti enzim secara berasingan.[2][22] Akhirnya, subunit yis B dan C telah diasingkan dengan penulenan bersama, dan didapati diperlukan dalam aktiviti enzim.[71] Walau bagaimanapun, subunit yis B dan C mempunyai identiti jujukan yang sangat rendah kepada homolog mereka dalam organisma lain, dan protein manusia yang sepadan telah dikenal pasti secara muktamad hanya selepas mutasi dalam ketiga-tiga didapati menyebabkan sindrom Aicardi-Goutières.[2]